Metoda panalungtikan genetik molekular

Ngajajah tur nangtukeun ragam basa dina metoda genetik struktur DNA dipaké molekul. Pikeun unggal wilayah DNA nu explores wilayah ieu kromosom, gén atawa alél, métode béda. Kaayaan unggal metoda genetik molekular ngandung sababaraha atawa manipulasi séjén tina RNA jeung DNA. Kabéh metodeu ieu dicirikeun ku hiji pajeulitna loba pisan, tanpa kaayaan laboratorium teu bisa dipigawé, sarta staf kudu kacida mumpuni. karya ieu dilumangsungkeun dina sababaraha tahap.

hambalan

Kahiji, RNA atawa DNA sampel bisa dihasilkeun. Di dieu, metoda genetik molekular bisa dilarapkeun ka ampir sagala bahan: a serelek getih, leukosit, fibroblasts budaya, mukosa (scraped), malah anu follicles bulu, - DNA tiasa didapet tina sampel nanaon. Ieu cocog ngagunakeun sagala métode genetik molekular sarta sagala rupa pilihan maranéhanana sarta geus DNA lila papisah disimpen beku. Tahap kadua dedicated ka akumulasi tina fragmen nu dipikahoyong (Gedekeun) DNA, sabab mantuan mastikeun réaksi ranté polimérase di vitro (dina vitro tanpa involvement organisme hirup). Hasilna, dipilih DNA sempalan multiplies ku réaksi ranté ieu, sarta jumlah nambahan DNA sacara harfiah jutaan kali.

Lengkah katilu dina métode panalungtikan genetik molekular dianggap pangwatesan dikalikeun DNA (fragméntasi ieu, tearing atawa motong). Pangwatesan dipigawé ku Éléktroforésis dina polyacrylamide atanapi gél agarose. Metoda ieu molekul-genetik diajar di sempalan DNA ngamungkinkeun dulur nyandak hiji posisi nu tangtu dina gél nu. Saterusna, gél kasebut diperlakukeun kalayan ethidium bromide, sanggup mengikat keur DNA, nu irradiation kalayan sinar ultraviolet, teras kasebut nyaéta dimungkinkeun pikeun niténan porsi pendaran. Molekular métode diagnostik genetik nu variatif sarta sababaraha, tapi dua hambalan kahiji anu umum ka sadaya. Tapi dina urutan pikeun ngaidentipikasi popotongan DNA, gél bisa warna, jeung loba metoda aya lianna.

spésiés

Metodeu paling langsung tur nyebar pikeun detecting mycobacteria mungkin kaasup metoda pembelajaran DNA genetik molekular luhur. panggih na éta, dina raraga nangtukeun bahan ranté scan tina popotongan husus DNA tina patogén. téhnik diagnostik genetik molekular teu acan gaduh cara leuwih efisien ngakuan kasakit kayaning tuberkulosis. Ngagunakeun réaksi ranté polimérase (PCR), anjeun tiasa pastikeun yén DNA aslina bakal nambahan jumlah salinan dina juta kali, maksudna, bakal aya Gedekeun, sarta eta bakal nembongkeun hasil. Tingkat sensitipitas pisan tinggi - leuwih ti salapan puluh-lima persén, nu Kauntungan utama tina metoda ieu.

Sesa metodeu molekular-genetik panalungtikan kana efektivitas ngahasilkeun sababaraha salinan sacara harfiah dua kali, saprak dina hal ieu sampel drafting nembongkeun réntétan oligonucleotide husus ngaronjat kana saratus genep kali. Malah diagnosis budaya TBC sahiji sistem engapan nyata nurunkeun sensitipitas na. Ieu naha ubar modern ieu dumasar kana métode genetik molekular diagnosis tuberkulosis. Hiji métode digambarkeun mangrupa éféktif utamana lamun kaayaan patogén ti variability antigenic tinggi, nangtukeun yen cara séjén leuwih hésé - merlukeun husus média gizi sarta cultivating lila. métode genetik biokimia na molekular ngahasilkeun éfék anu pohara béda dina hasil.

diagnosis tuberkulosis

Marshall PCR diagnosis tuberkulosis ilahar migunakeun eta urutan DNA nu husus pikeun sakabéh opat rupa kasakit. Pikeun ngahontal éta tujuan ieu mindeng ngagunakeun primers nu ngadeteksi runtuyan IS elemen (IS-986, IS-6110), salaku elemen ieu characterize spésiés pohara migratory tuberkulosis Mycobacterium tur salawasna sababaraha salinan hadir dina génom nu. Ogé ékstraksi DNA bisa dilumangsungkeun ti budaya murni tur klinis (sputum pasien) ku sagala metoda sejenna merenah. Contona, metoda Gludug aya dimana panyangga lysis digunakeun dumasar kana thiocyanate guanidine sarta silika salaku DNA pamawa. Jumlah pasien nu beda bacteriological goréng ngaronjatkeun unggal taun, sarta ku kituna dina praktekna klinis geus ngadegkeun hiji tingkat lengkep beda organisasi: metoda molekular-genetik diajar DNA geus maén peran utama dina diagnosis nu.

Najan kitu, urang kudu ngaku yen teu tanpa drawbacks. Metodeu PCR nya éta ngagunakeun mindeng brings jumlah badag hasilna palsu-positif, sarta alesan nu teu ngan kasalahan teknis, tapi ogé fitur sahiji metoda sorangan. Sajaba ti éta, make metoda ieu diagnosis nangtukeun viability of mycobacteria, nu geus pasti, éta saukur mungkin. Tapi disadvantage ieu teu pangpentingna. métode genetik molekular diagnostics PCR entail résiko kontaminasi DNA mycobacterial. syarat sertifikasi pikeun alesan ieu nu pikeun laboratorium PCR dirancang sacara éksklusif teuas, maranehna menta tilu enggon misah. téhnologi PCR nyaeta modern jeung pisan kompléks, merlukeun pamakéan alat-alat luyu jeung tanaga tinggi-dilatih.

bacterioscopy

Nalika hasilna diagnosis analisis kudu dibandingkeun jeung data sejen: ujian klinis, radiography, ngolesan mikroskop, potong komo respon kana perlakuan husus anu pohara penting. Dina runtuyan ieu, nu ngulik PCR téh ukur salah sahiji komponén. Ngadeteksi patogén dina diagnosis mimiti tiasa metodeu basajan jeung quickest - bacteriological.

Aya anu dipaké mikroskop cahya (ngawarnaan Ziehl-Neelsen) jeung fluoresensi (ngawarnaan fluorochromes). Kauntungannana nyaéta speed ngolesan hasil. Tapi aral na ieu rightly dianggap kapasitas kawates alatan sensitipitas low. Sanajan kitu, metoda ieu dirumuskeun rekomendasi WHO salaku paling ekonomis jeung taneuh pikeun ngadeteksi penderita tuberkulosis. Beungeut metoda bacteriological mycobacteria boga nilai prediksi na diperkirakeun ékskrési quantitatively baktéri. Leuwih percaya diri nungkulan eta molekular métode panalungtikan genetik tuberkulosis.

budaya

Pangwanoh hadé tina mycobacteria ngakuan studi kultural. Sowing bahan patologis eta dijieun kana medium endog: Mordovsky, Finn II, lj, sarta kawas. Tolok ukur lalawanan tina mycobacteria kana obat tur bukti langsung tina efektivitas sababaraha mycobacteria jeung koloni maranéhna vitro, upami metoda dilarapkeun of budaya panalungtikan. Pikeun ngaronjatkeun persentase isolasi of mycobacteria inokulasi tina bahan patologis ieu dilaksanakeun dina sababaraha lingkungan.

Rapat kaperluan sababaraha budaya, patogén kaasup hibah sarta cairan. Dipaké dina sistem ieu sarta otomatis tipe Pangukuran pertumbuhan VANTES. Pepelakan kudu diayakeun di inkubasi nepi ka tujuh nepi ka dalapan minggu. Ku waktu ieu potong jeung kurangna tumuwuhna bisa dianggap négatip. Cara paling éféktif pikeun ngadeteksi Mycobacterium tuberculosis mertimbangkeun sampel biologis: bahan nginféksi babi guinea diagnostik, nu pisan susceptible ka TB.

sababaraha inohong

médan metot pangajaran, anu dibuka ku diagnostics PCR ieu diajar teh M. tuberculosis - inféksi laten. Konsep modern inféksi TB nunjukkeun yen kaluar tina saratus jalma anu aya di kontak kalayan M. tuberculosis, salapan puluh-bisa ogé jadi kainféksi, tapi ngan sapuluh aya ti antarana anu kasakit aktif keur dimekarkeun. Batur gaduh kekebalan TB, sarta kusabab salapan puluh persén kasusna inféksi tetep laten. Ngadeteksi pola hiji deui geus mantuan metoda genetik molekul.

Geneticists disebutkeun yen lima puluh lima per cent jalma anu pepelakan patologis bahan éta négatip, sarta dalapan puluh persén urang kainfeksi M. tuberculosis, tapi nyérélék kalawan henteu manifestasi radiographic panyakit, PCR réspon positif narima. Ieu metoda diagnostik genetik mantuan pikeun ngaidentipikasi penderita di resiko ku studi PCR, kalawan hasil nganalisa maranéhanana (mikroskop budaya) anu négatip, sarta infeksi subclinical M. tuberculosis éta hadir.

panalungtikan modérn

Féderasi Rusia sarta laboratorium bacteriological make hiji metodeu gancangan of kadarna mutlak: aktivitas réduktase nitrat of mycobacteria dites ku Griess réagen. puseur anti TB ngagunakeun padika anu ngamungkinkeun pikeun nangtukeun lalawanan narkoba. seeding ieu média cair, mana otomatis radiometric sarta sistem akuntansi fluoresensi tumuwuhna mycobacteria. léngkah analisis sapertos dipigawé gancang - nepi ka dua minggu.

Ayeuna, métode anyar anu keur dimekarkeun: lalawanan ubar tina mycobacteria diukur dina tingkat genotype. Ulikan ngeunaan mekanisme molekular gén lalawanan sarta némbongkeun ayana di mycobacteria. gén ieu pakait sareng lalawanan ka ubar nu tangtu. Contona, gén kasA, inhA, katG tahan ka isoniazid, gén rpoB - gén RNA 16Sp rifampicin na rpsL - streptomycin, emb1 - mun ethambutol, gyrA - a fluoroquinolone jeung saterusna.

mutations

Diagnosis modern nyata ngaronjat metoda hambalan molekular-genetik pikeun diajar DNA jeung diwenangkeun pikeun ngalakonan studi badag-skala mutations dina sakabéh spéktrum maranéhanana. Ayeuna urang nyaho yén mutations paling umum dina 516, 526 sarta 531 codons gén rpoB, sarta dicirikeun résistansi ka sagala rupa ubar. Aya sakabeh lingkup métode pikeun ketikan of mycobacteria maké teu ngan metoda tradisional - biokimia, biologis jeung budaya, tapi ogé loba dipaké téhnik genetik molekular modern. Geus aya nyukupan sarta nyadiakeun metoda diagnosis nu bener pikeun deteksi rupa kasakit monogenic. Éta téh dumasar kana studi DNA di wewengkon pasti of a gén nu tangtu. Ieu biasana mangrupa prosés kompléks, waktos consuming tur mahal, tapi data anu disadiakeun ku analisis genetik molekular, leuwih akurat tur informatif ti data sadaya nganalisa lianna.

Ieu geus lila dipikawanoh yén DNA teu robah keur sakabéh kahirupan di organisme yén éta téh dina sagala sél odnakova nucleated, sarta ieu ngamungkinkeun nyandak analisis pancen sadaya sél awak, iraha wae panggung ontogeni. gén nu ruksak bisa ditandaan saméméh pintonan gejala pangheulana panyakit klinis pinuh skala, kitu ogé di urang heterozygous cageur, tapi gaduh mutasi dina gén dina. métode diagnostik kasakit turunan genetik molekular ngidinan pikeun nembongkeun na (pendekatan langsung, DNA-diagnostics), kitu ogé cara analisa segregation panyakit dina kulawarga jeung kamajuan loci DNA (polymorphisms genetik), nu numbu raket ku gén ruksak (ie, pendekatan langsung DNA-diagnostics). Langsung atawa henteu langsung - sagala diagnostics DNA dumasar kana métode identifying nyangkokkeun diartikeun mastikeun tina DNA manusa.

métode langsung

métode langsung tina diagnosis DNA téh lamun nu gén penjahat kasakit turunan anu dipikawanoh, kitu ogé dipikawanoh, sarta jenis ti mutations na. Contona, hiji metode langsung cocog dina jumlah kasakit. Ieu chorea Huntington urang (extension CTG-repeats), phenylketonuria (R408W), fibrosis hampru (delF508, mutations utama) jeung kawas. Kauntungan utama tina metodeu langsung nyaéta akurasi diagnostik kaluar liwat-dipiboga, sarta aya teu kudu ngalakukeun analisis DNA tina sesa kulawarga. Mun hiji mutasi dina pakait gén ieu kapanggih, éta ngamungkinkeun persis approve a diagnosis turunan, genotype tekad pikeun sesa kulawarga burdened.

Kauntungan sejen tina diagnosis langsung dianggap pikeun ngaidentipikasi hiji pamawa heterozygous of mutations goréng ti baraya jeung kolotna anu maot ti kasakit. Ieu hususna leres kasakit autosomal recessive. Kalemahan sahiji metodeu langsung ogé anu aya. Panawaran aranjeunna, anjeun kudu nyaho persis localize gén abnormal, struktur exon-intron spéktrum sarta mutations na. Henteu sakabeh kasakit monogenic dinten nampi informasi misalna. métode langsung Informativeness teu bisa dianggap lengkep, sabab salah jeung gén sarua bisa boga angka nu gede ngarupakeun mutasi patologis nu nyababkeun ngembangkeun kasakit turunan.

padika teu langsung

padika teu langsung di diagnostics DNA nu dipaké di sakabéh, dina kasus séjén, lamun gén ruksak teu dicirikeun, tapi ngan chromosomally, atawa lamun diagnosis garis teu masihan hasilna (eta kajadian, lamun gén organisasi molekular kompléks atawa extent badag, upami aya pisan mutations patologis). padika teu langsung dilaksanakeun analisis segregation of spidol polymorphic di kulawarga allelic. Spidol kapanggih di wewengkon kromosom sarua atawa locus téh raket numbu ka kasakit sarta ngagambarkeun hapusan atanapi insertions, panggantian titik, repeats, sarta polymorphism maranéhanana nyaéta alatan jumlah béda sél di blok.

Nu pangmerenahna pikeun diagnosis dianggap microsatellite na minisatellite polymorphisms langsung, nu lega disebarkeun dina génom manusa. nilai maranéhanana dinyatakeun dina kandungan informasi tinggi, upami ruksakna jarak genetik antara kamajuan sarta gén nu teu badag teuing. Dina kasus dimungkinkeun, akurasi estimasi ditangtukeun ka extent badag frékuénsi rékombinasi antara kamajuan polymorphic jeung karuksakan. métode diagnostik langsung ogé nyadiakeun hambalan awal wajib frékuénsi alél ulikan populasi dianalisis diantara penderita sarta operator of mutations, tambah kabutuhan tina nangtukeun kamungkinan rékombinasi of nonequilibrium na adhesion spidol na alél mutant.

métode séjén

bagéan pondok tina RNA atawa DNA, kitu ogé gén tunggal visualized diulik mikroskopis teu kaci, kituna, pikeun ngaidentipikasi mutations diperlukeun ku diagnosis genetik molekul. Aya "Asasi Manusa Genome Project", sakumaha ogé kamajuan lianna di genetika molekulér greatly dimekarkeun kamungkinan diagnosis kasakit turunan - duanana pamandangan na postnatal. metodeu ieu bisa nyadiakeun beungeut mimiti na ngadamel poly- prediksi sarta panyakit monogenic, anu perdana lumangsung di dewasa. Hanjakal, alatan kamampuhan teknis ngeunaan ngulik genetik molekular nu kadang saluareun watesan etika nu disetél dina hubungan warisan, utamana lamun diagnosis nu aya dina rumaja jeung budak leutik.

Struktural jeung numeris Abnormalitas kromosom nu jadi sabab paling umum panyakit jeung kanker, sarta loba malformations. aberrations kromosom perlu diidentifikasi, nu penting pikeun sangakan kulawarga - ka assess ramalan, bareng jeung resiko réproduktif di pregnancies hareup. Analisis kromosom teh "standar emas" tina diagnosis genetik, tapi ngan bisa laksana. Mung metode analisis genetik molekular tiasa ngalakukeun deui, lantaran aya dipake Kloning téhnologi dumasar labél fluoresensi sanggup sensitipitas tinggi maranéhna pikeun ngaidentipikasi parobahan kromosom halus anu teu mungkin keur ngadeteksi klasik studi cytogenetic. Téhnik ieu téh beuki ngembangna kamampuhan diagnostik urang, nalika nalungtik, barudak jeung disabilities developmental, retardation mental, jeung loba kasakit turunan lianna.

timuan

Hal ieu kacida penting pikeun manusa éta struktur gén jeung fungsi pangaweruh, rupa variability, kamampuhan pikeun ngadeteksi kasakit turunan anu lumangsung di sambungan kalawan ngembangkeun genetik molekul. métode na anu aimed dina ulikan ngeunaan molekul DNA - na lamun normal, sarta lamun eta ruksak. Persiapan urutan Deoxyribonucleic acid nukléotida (DNA) manjangan dina hambalan tina narima sampel pikeun ngaidentipikasi popotongan individu. Isolasi DNA génomik ti sél, wangenan (tearing), Gedekeun (kloning), Éléktroforésis sahiji fragmen (misahkeun muatan listrik maranéhanana sarta beurat molekul ku gél agarose). Idéntifikasi sahiji fragmen husus ayana dina beungeut a belang diskrit.

Lajeng jadi meunang kalakuan saringan husus, ngaliwatan nu pas unggal hibridisasi sempalan ku popotongan DNA diklon atanapi panyilidikan radioaktif sintétik mangrupakeun kontrol, anu bakal sarua jeung tiap sample test. Lamun ngarobah posisi atawa panjang dibandingkeun kalayan usik, upami hiji peupeusan anyar atawa ngiles - kabeh ieu nunjukkeun yén gén dianalisis geus undergone restructuring dina sekuen nukléotida. Aya dalapan téhnik dasar tina ngulik genetik molekular: sequencing (tekad tina runtuyan DNA), réaksi ranté polimérase (kanaékan jumlah tina urutan), persiapan primers dipikawanoh gén, DNA kloning, produksi molekul rékombinan diturunkeun protéin alatan molekul rékombinan, nyieun hiji set lengkep (kempelan perpustakaan) diklon popotongan nya éta diala ku ngagunakeun pangwatesan.